OPTIMASI ANNEALING TEMPERATURE PRIMER MRNA RECK DENGAN METODE ONE STEP QRT-PCR

Aprilia Indra Kartika

Abstract


Identifikasi mRNA untuk mengukur ekspresi suatu gen dapat dijadikan sebagai alat diagnostik suatu penyakit. mRNA RECK menghasilkan protein RECK yang terbenam dalam membran glikoprotein sel sehingga memperkuat integritas sel. Ekspresi mRNA RECK dikaitkan dengan proses fisiopatologis dalam kanker ovarium.

Metode one step qRT –PCR sangat sensitif dan akurat, namun membutuhkan kompleksitas yang tinggi. Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi hasil kuantifikasi mRNA adalah suhu annealing primer mRNA RECK.

Penelitian ini melakukan optimasi suhu annealing secara in-silico melalui http://tmcalculator.neb.com/ dan http://www.biophp.org/minitools/melting_temperature diperoleh suhu 49°C (57°C primer forward; 54°C primer reverse) dan 51,8°C primer forward; 51,1°C primer reverse. Proses selanjutnya yaitu melakukan running qRT-PCR menggunakan suhu bertingkat. Suhu 55,6°C pada awal optimasi menunjukkan hasil yang baik terlihat dari kurva meltpeak yang spesifik pada suhu 75°C. Namun setelah proses running menggunakan sampel yang berbeda, hasil meltpeak tidak spesifik. Proses optimasi kedua diperoleh suhu 52,5°C dengan meltpeak spesifik suhu 76,5°C. Optimasi annealing dilanjutkan dengan melakukan persamaan konsentrasi RNA template menggunakan pengenceran perbandingan 1:3 (RNA: Nuclease Free Water (NFW))

 

Kesimpulan dari penelitian ini diperoleh suhu annealing mRNA RECK sebesar 52,5°C dan pengenceran 1:3 RNA dengan NFW, serta penggunaan reagen KAPA one step PCR tanpa penambahan dUTP dan ROX high serta ROX low.

Keywords


Annealing Temperature, mRNA RECK, One step qRT-PCR

Full Text:

PDF

References


Bullock, M. D., Pickard, K. M., Nielsen, B. S., Sayan, A. E., Jenei, V., Mellone. M., Mitter, R., Primrose, J. N., Thomas, G. J., Packham, G. K., Mirenzami, A. H. 2013. Pleiotropic Actions of miR-21 Highlight the Critical Role of Deregulated Stromal microRNAs During Colorectal Cancer Progression. Cell Death and Disease. 4: 684

Malhotra, K., Foltz, L., Mahoney, W.C., Schueler, P. A. 1998. Interaction and effect of annealing temperature on primers used in differential display RT-PCR. Nucleic Acids Research. 26 (3): 854-856

Bustin, S.A. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Review. Journal of Molecular Endocronology. 25 : 169-193

Hirata, H., Ueno, K., Shahryari, V., Deng, G., Tanaka, Y., Tabatabai, Z.L., Hinoda, Y., Dahiya, R. 2013. MicroRNA-182-5p Promotes Cell Invasion and Proliferation by Down Regulating FOXF2, RECK and MTSS1 Genes in Human Prostate Cancer. Plos One. 8(1): 1-12.

Hong, F., Li, Y., Xu, Y., Zhu, L. 2013. Prognostic Significance of Serum microRNA-221 Expression in Human Epithelial Ovarian Cancer. Journal of International Medical Research. 41(1): 64-71.

Kang, H. G., Kim, H. S., Kim, K. J., Oh, J. H., Lee, M. R., Seol, S. M., Han, I. 2007. RECK Expression in Ostecarcinoma: Correlation with Matrix Metalloproteinases Activaton and Tumor Invasiveness. Journal of Orthopaedic Research. 83

Kimura, T., Okada, A., Yatabe, T., Masashi, O., Toyama, Y., Noda, M., Okada, Y. 2010. RECK Is Up-Regulated and Involved in Chondrocyte Cloning in Human Osteoarthritic Cartilage. The American Journal of Pathology. 176 (6): 2858-2866.

Korbie, D.J., & Mattick, J.S. 2008. Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nature Protocol. 3 (9): 1452-1456

Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., & Pantel, K., 2014. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol, 11(3):145-56.

Siddesha, J. M., Valente, A. J., Yoshida, T., Sakamuri, S. S. V. P., Delafontaine, P., Iba, H., Noda, M., Chandrasekar, B. 2014. Docosahexaenoic Acid Reverses Angiotensin II-Induced RECK Suppression and Cardiac Fibroblast Migration. Cell Signal. 26 (5): 933-941.

Yeh, H. H., Tseng. Y. F., Hsu, Y. C., Lan, S. H., Wu, S. Y., Raghavaraju, G., Cheng, D. E., Lee, Y. R., Chang, T. Y., Chow, N. H., Hung, W. C., Liu, H. S. 2015. Ras Induces Experimental Lung Metastasis Through Up-Regulation of RbAp46 to Suppress RECK Promoter Activity. BMC Cancer. 15: 172-186.


Refbacks

  • There are currently no refbacks.


Statistik Pengunjung

web
counter

Creative Commons License
This work is licensed under a

Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.